Составитель:

заведующая клинико-диагностической лабораторией У «Гомельская областная туберкулёзная клиническая больница» Т.Д. Борисенко

Рецензенты:

главный специалист по клинической лабораторной диагностике УЗ Гомельского областного исполнительного комитета  А.А. Кудря

заведующая лабораторией диагностики вирусных и особо опасных инфекций ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» С.А. Думова

Характеристика вируса типа А (H1,N1)

Высокопатогенный вирус гриппа А (H1,N1) (ВПВГА) относится к семейству Orthomyxoviridae. Геном вируса представлен восемью фрагментами РНК. По данным генетического анализа, вирус гриппа, вызвавший вспышку заболевания среди людей в Мексике и США весной 2009 года, является реассортантом вирусов гриппа свиней.

Вирус передаётся от человека к человеку воздушно-капельным путём. Не исключён также и контактно-бытовой путь передачи. Инкубационный период при гриппе ВПВГА составляет обычно 2-3 дня, и вирус может выделяться в окружающую среду заболевшим 7 дней и более. Клиническая картина заболевания разнообразна – от бессимптомных форм до тяжелых пневмоний. Вирус чувствителен к озелтамивиру и занамивиру.

Вирус чувствителен к повышенным температурам и погибает при нагревании до 70⁰С в течении 30 минут. Вирус также чувствителен к различным дезинфектантам, обладающим вирулицидным действием.

ВПВГА характеризуется высокой антигенной изменчивостью. Опасения Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) связаны с генетической новизной вируса и его потенциальной способностью к дальнейшей реассортации, вследствие чего возможно возникновение более агрессивных вариантов инфекции.

Эпидемиология

Наиболее известные эпидемии вызванный вирусом гриппа А (H1,N1): «испанка» - пандемия 1918-1920 годов, «русский грипп» - пандемия 1977-1978 годов, «мексиканский» или «свиной» грипп – пандемия, начавшаяся в марте-апреле 2009 года. У переболевших остаётся частичный иммунитет.

ВОЗ присвоила вирусу гриппа А (H1,N1) шестую степень угрозы (из шести). Степень угрозы по ВОЗ не характеризует патогенность вируса (то есть опасность заболевания для жизни людей), а указывает на его способность к распространению.

Определение случаев заболевания

Подтверждённый случай – заболевание, при котором имеются симптомы острого респираторного заболевания (ОРЗ) с лабораторно подтверждённой инфекцией, вызванной ВПВГА одним из следующих методов:

l      полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени

l      выделение вируса в культуре клеток.

Вероятный случай – у человека имеет место ОРЗ, при этом результат ПЦР положительный на грипп типа А, но отрицательный на подтип Н1 или Н3.

Подозрительный случай – случай, при котором:

l      У человека имеется ОРЗ, и этот человек тесно контактировал с лицом с подтверждённой инфекцией, вызванной ВПВГА, в то время, когда это лицо находилось в состоянии болезни, или

l      У человека имеет место ОРЗ, и известно, что этот человек недавно контактировал с животным с подтверждённой или подозреваемой инфекцией, вызванной ВПВГА, или

l      У человека имеет место ОРЗ, и этот человек совершил поездку в район, где имеют место подтверждённые случаи ВПГА.

При поступлении из организации здравоохранения информации о подтверждённом, вероятном или подозрительном случае заболевания людей ВПГА, специалистами регионального центра гигиены и эпидемиологии проводится эпидемиологическое расследование.

Организация лабораторной диагностики

Сбор, хранение и транспортировка образцов для лабораторной диагностики

Сбор клинического материала осуществляет обученный медицинский работник лечебно-профилактического учреждения в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор), защитных очках или щитках для защиты лица, бахилах, двойных резиновых перчатках в стерильные флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами.

Для диагностики заболевания могут быть использованы следующие образцы:

l      мокрота

l      мазок из носа

l      мазок из носоглотки

l      аспират из носоглотки

l      смыв из носовой полости

l      содержимое эндотрахеальных трубок

По клиническим показаниям к ним могут быть добавлены:

l      трахеальный аспират

l      бронхоальвеолярный лаваж

l      биоптат легочной ткани

l      ткань легкого или трахеи, взятая post mortem.

Обследованию на высокопатогенный вирус гриппа подлежат все больные с тяжелым течением ОРЗ. Забор материала от пациентов (умерших) с подозрением на инфекцию ВПВГА проводят в лечебно-профилактическом учреждении (ЛПУ) после изоляции больного. Первичное исследование материала от больного осуществляется методами ПЦР в режиме реального времени на базе лаборатории диагностики вирусных и особо опасных инфекций ГУ «Гомельский областной Центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (ОблЦГЭ и ОЗ).

Курьер получает в лаборатории диагностики вирусных и особо опасных инфекций ОблЦГЭ и ОЗ стерильные пробирки с физраствором и стерильные тампоны, упакованные по 10 штук. Пробирки и тампоны хранятся в  приемном покое УГОТКБ, годны для использования 7 дней. В приёмном покое хранятся также одноразовые стерильные пластиковые сухие пробирки объёмом 50 мл для сбора биологического материала (мокрота, содержимое эндотрахеальных трубок, ткань лёгкого и др.).

Оптимальные сроки забора

l      до начала этиотропной терапии

l      мазок из носовой полости, зева - не позднее 5 дня от начала заболевания (лучше первые 3 дня)

l      парные сыворотки крови 1-я сыворотка не позднее 3-5 дня заболевания.
2-я сыворотка через 14 дней

l      секционный материал - в день смерти больного

Техника забора клинического материала

Венозная кровь

Для серологического исследования забираются парные сыворотки крови. Первую пробу крови берут в первые 3-4 дня заболевания (или в первый день обращения за медицинской помощью). Кровь забирается в чистую сухую пробирку шприцем из вены в количестве 3-5 мл у взрослых.

Первичная обработка крови проводится в клинико-диагностической лаборатории УГОТКБ. Венозная кровь, отстаивается 30 минут при комнатной температуре. При помощи стеклянной палочки отделяют столбик сгустка от стенок пробирки. Пробирку центрифугируют при 1500 об/мин 10 минут. Полученную сыворотку отсасывают автоматическим дозатором с одноразовым наконечником. На каждую сыворотку используется отдельный наконечник. Сыворотка не должна быть гемолизированная, хилезная, с признаками бактериального пророста.

Первую пробу сыворотки хранят при температуре минус 20⁰ С до получения второй сыворотки крови. Повторное оттаивание – замораживание не допускается.

Вторую пробу берут через 14 дней после начала заболевания. Обе пробы одновременно отправляют для исследования в лабораторию диагностики вирусных и особо опасных инфекций в течение 24 часов после забора второй сыворотки.

Одиночные сыворотки лаборатория диагностики вирусных и особо опасных инфекций не принимает, т.к. диагностика осуществляется на основании 4-х кратного увеличения титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой.

Мазок из полости носа

Мазок из полости носа забирают сухими стерильными ватными тампонами. Перед взятием материала полость носа необходимо очистить от слизи, лейкоцитов, слущенных клеток эпителия.

Тампон ввести легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опустить книзу, ввести в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, сделать вращательное движение и удалить вдоль наружной стенки носа. Мазок берётся из обеих полостей носа. Тампоны погрузить в стерильную пробирку с 3 мл транспортной среды (фосфатно-солевой буфер или физраствор), отломать концы палочек и плотно закрыть пробкой.

Материал в течение 1 - 4 часов доставляется в лабораторию.

Мазки должны быть забраны таким образом, чтобы в них содержались клетки, имеющие диагностическое значение - цилиндрический эпителий из глубоких отделов носа, в котором размножаются вирусы. Мазки, содержащие клетки плоского и переходного эпителия из наружных отделов носа не информативны и исследованию не подлежат.

Мазок из ротоглотки

Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, нёбных дужек и задней стенки ротоглотки.  Тампоны погрузить в стерильную пробирку с 3 мл транспортной среды (фосфатно-солевой буфер или физраствор), отломать концы палочек и закрыть пробкой.

Секционный материал

Кусочки ткани легких берут асептически. Объем проб – около 1-2 см?. Секционный материал помещают в стерильную посуду и транспортируют в термоконтейнере в течение 24 часов.

Хранение

l      Все виды собранного биологического материала должны храниться в больнице не более суток при температуре 2-8°С

l       Сыворотка хранится в замороженном состоянии

Транспортировка

Каждая проба представляется с сопроводительным документом. Направление на исследование материала на ВПГВА методом ПЦР представлено в Приложении 1. Материал взятый post mortem представляется с направлением по форме Приложения 2. Для исследования на грипп и другие ОРВИ (парагрипп, аденовирусная инфекция, РС-инфекция) методом РИФ с направлением на обычном бланке для исследования биологического материала.

Материал доставляется в лабораторию в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами. При необходимости используются специальные среды для транспортировки вирусосодержащего материала (выдает лаборатория диагностики вирусных и особо опасных инфекций ОблЦГЭ и ОЗ).

Все транспортируемые образцы должны быть упакованы в тройную упаковку, содержащую три упаковочных слоя. Упаковка должна быть выполнена с учётом предотвращения любой утечки содержимого, выдерживать удары и нагрузки, имеющие место при транспортировке. Между первичной ёмкостью и вторичной упаковкой должен находиться мягкий абсорбирующий материал, в количестве достаточном для впитывания всего содержимого первичных ёмкостей. При транспортировке нескольких клинических образцов – каждый упаковывается в первичную упаковку, исключается любой контакт между ними.

Методы лабораторной диагностики

Иммунофлюоресцентный анализ

Позволяет обнаружить антиген вируса гриппа в клетках цилиндрического эпителия дыхательного тракта больного за счёт взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами. Вирус и инфицированная клетка очень неустойчивы, забор материала нужно проводить как можно быстрее после появления клинических симптомов, т.к. число инфицированных клеток уменьшается по ходу болезни. Вследствие мутаций вновь появившиеся высокопатогенные штаммы вируса гриппа свиней изменили свои антигенные свойства, вследствие чего иммунофлюоресценция может быть ложноотрицательна. Поэтому метод не применяется для диагностики ВПВГА, а используется для диагностики гриппа А (кроме свиного), гриппа В, парагриппа, аденовирусной и респираторно-синтициальной инфекции.

Серологические тесты

Это методы определения специфических антител в парных сыворотках крови с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Серологический анализ позволяет определить заболевание, вызванное  одним из 6 подтипов гриппа А, включая свиной и птичий, гриппом В.

Полимеразная цепная реакция

Определяют РНК вируса в диагностическом материале. Результаты получают через 24 часа.  При исследовании методом ПЦР анализ проводится в два этапа: I этап – обнаружение вирусов гриппа А, II этап – идентификация субтипов H1N1 и H3N2.

Выделение вируса в культуре клеток или куриных эмбрионах

Метод позволяет не только идентифицировать возбудителя, но и изучить его антигенные, фенотипические, генетические свойства, определить чувствительность к лекарственным препаратам. Это самый длительный метод - результаты через 2-10 дней. Материал для исследования является отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева, секционные ткани. Для транспортировки используют специальные среды. Исследование проводится в г. Минске в лабораториях Национального Центра Гриппа.

Лаборатория диагностики вирусных и особо опасных инфекций ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» осуществляет диагностику широкого спектра вирусных, бактериальных, протозойных инфекций, гельминтозов. Правила забора и доставки биологического материала представлены в Приложении 3.

Литература

 

1. Постановление МЗ РБ № 48 от 01.10.2000 г. «О мероприятиях по профилактике гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций»
2. Инструкция по применению «Лабораторная диагностика заболевания людей высокопатогенным гриппом» от 08.05.2009 г. № 049-05
3. Руководство «Порядок учёта, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов 1-4 групп патогенности» от 30.12.2002 г. №11-7-13-2002
4. СП 1.2.011-94 «Безопасность работы с микроорганизмами 1, 2 группы патогенности»
5. Инструктивно-методическое письмо «Правила забора и доставки биологического материала в лабораторию диагностики вирусных и особо опасных инфекций ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» № 8.7.2./40 от 29.05.2009 г.

 

 

 

 

Приложение 1

 

Направление № ______________

для лабораторного исследования биологического образца от больного ОРИ.

ФИО
Год рождения, возраст
Пол
Профессия
Адрес и телефон
Дата появления симптомов
Дата забора образца
Диагноз
Симптомы заболевания	есть	Нет
Температура
Боли в горле
Одышка
Кашель
Миалгия
Головная боль
Конъюнктивит
Насморк
Диарея
Тошнота, рвота
Судороги
Нарушение сознания
Боли в суставах
Кровотечение из носа
Другие
Анамнез	да	нет
Вакцинирован ли?
Применение противогриппозных препаратов (какие)
Есть ли сопутствующие заболевания и/или осложнения (если да, то описать)
Материал для исследования
Мазки из носа
Мазки из носоглотки
Назофарингеальный аспират
Мокрота
Парные сыворотки
Адрес учреждения, направляющего образец
Название учреждения
ФИО врача
Телефон
Факс	-
e-mail	-
Образец направлен ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья», г.Гомель, ул. Моисеенко , 49
ГУ РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, НЦГ, Минск, ул Филимонова, 23, к.110, тел. 237 62 95, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.

 

 

Приложение 2

Направление № _________

для лабораторного исследования биологических образцов,

взятых post mortem

 

ФИО
Год рождения
Пол
Дата заболевания
Дата поступления в стационар
Дата смерти
Дата забора образца
Клинический диагноз
Сопутствующие, фоновые заболевания
Предварительный патологоанатомический диагноз
Анамнез	да	нет
Вакцинирован ли?
Применение противогриппозных препаратов (какие)
Материал для исследования
Материалы, взятые post mortem
Адрес учреждения, направляющего образец
Название учреждения
ФИО врача
Телефон
Факс
e-mail

 

 

 

 

 

Приложение 3

 

Грипп и другие ОРВИ (парагрипп, аденовирусная инфекция, РС – инфекция)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
РИФ, ПЦР	мазок из носовой полости	не позднее 5 дня от начала заболевания
	секционный материал	в день смерти больного
РТГА	парные сыворотки крови	1-я сыворотка не позднее 3-5 дня заболевания. 2-я сыворотка через 14 дней.
Метод клеточных культур	секционный материал	в день смерти больного
	мазок из носовой полости, зева	не позднее 5 дня от начала заболевания

 

TORCH - инфекции (токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная инфекция, герпетическая инфекция)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	При подозрении на перечисленные инфекции ! При подозрении на краснуху: у беременных забирается незамедлительно, у остальных больных кровь следует забирать на 4-7 день появления сыпи.
РИФ	урогенитальные мазки	При подозрении на герпетическую инфекцию
ПЦР	урогенитальные соскобы	При подозрении на герпетическую инфекцию, цитомегаловирусную инфекцию.

 

Заболевания передающиеся половым путём (урогенитальный хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, гарднереллёз, трихомониаз, папилломавирусная инфекция)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
РИФ	урогенитальные мазки	При подозрении на уреаплазмоз, микоплазмоз, хламидиоз
ПЦР	урогенитальные соскобы	При подозрении на ЗППП

 

Вирусные инфекции (корь)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	4-7 дни от появления сыпи

 

 

Вирусные инфекции (эпидпаротит)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	парные сыворотки крови	1-я сыворотка: 3 день заболевания. 2-я сыворотка: через 14 дней.

 

Вирусные инфекции (клещевой энцефалит)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	Первая неделя заболевания
РСК	парные сыворотки крови	1-я сыворотка: 3 день заболевания. 2-я сыворотка: через 14 дней.

 

Вирусные гепатиты
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	При подозрении на вирусные гепатиты, обследование контингентов групп риска с целью профилактики

 

Ротавирусная инфекция
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	фекалии	1-5 дни болезни

 

Энтеровирусная инфекция
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	3-й день заболевания
	ликвор	3-й день заболевания
	фекалии	с 1-го дня болезни
	носоглоточные смывы	с 1-го дня болезни
РИФ	ликвор	3-й день заболевания
	сыворотка крови	3-й день заболевания
ПЦР	ликвор	3-й день заболевания
	фекалии	с 1-го дня болезни
	носоглоточные смывы	с 1-го дня болезни
Метод клеточных культур	ликвор	3-й день заболевания
	фекалии	с 1-го дня болезни
	носоглоточные смывы	с 1-го дня болезни

 

 

 

Полиомиелит
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
Метод клеточных культур	фекалии	От больных c подозрением на полиомиелит и в случаях других ОВП в первые 3 суток 2 пробы по 2 флакона каждая с интервалом 24-48 часов
		От контактных в возрасте до 5 лет 1 проба в 2 флакона

 

Гельминтозы (цистицеркоз, описторхоз, эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
ИФА	сыворотка крови	В начале заболевания

 

Бактериальные инфекции (дифтерия, столбняк, коклюш, паракоклюш, сальмонеллёз, шигеллёз, сыпной тиф, иерсиниозы, псевдотуберкулёз, брюшной тиф, паратифы А и В, менингококковая инфекция)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
РПГА, РА, РНГА, РСК	парные сыворотки крови	1-я сыворотка: не позднее 3-5 дня заболевания. 2-я сыворотка: через 7-10 дней.

 

Бактериальные инфекции (Лайм-боррелиоз)
Метод исследования	Материал для исследования	Сроки взятия материала
РНИФ	парные сыворотки крови	1 сыворотка:10 дней после инфицирования 2 сыворотка: 3-6 недель после положительной первой сыворотки